Øvelse: Parvis alignment

• Kvaliteten af et alignment bestemmes af dets alignment score.
• Alignment score beregnes ud fra match/mis-match ved brugt af en alignment matrice (fx BLOSUM62 for proteinsekvenser).
• "Straffen" for at introducere gaps bestemmes efter to parameterer: "Gap opening" (koster meget) og "gap elongation" (koster lidt).
• To varianter af DP algoritmen:
• Globalt alignment (Needleman-Wunsch).
• Lokalt alignment (Smith-Waterman).

Trin 1 - basalt brug

1. Åbn align-siden hos EBI: http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/
   
   
2. Bemærk at der et en side med udførlig hjælp til hvordan man bruger deres alignment service - klik på "Emboss align help" ude til venstre (direkte link: http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/help.html).
• Bemærk at der er understøttelse for en lang række sekvensformater.
• Bemærk at der er link til en udførlig gennemgang af gaps (direkte link: http://www.ebi.ac.uk/help/gaps_frame.html).
  
  
3. Lad os i første omgang prøve at aligne et par serin-proteaser (fra UniProt). Den første (P29600) er den termostabile protease som Novozymes sælger til vaskepulver under navnet "Savinase". Sekvens nummer to er en anden termostabil serin-protease fra en helt anden art af Bacillus.
   

4. Kopier en sekvens ind i hver sekvens-boks. Sørg for at der er valgt "protein" som sekvenstype, "BLOSOM62" som alignment matrice og "needle (global)" som metode. Tryk på "run" for at aligne sekvenserne.
• Læg mærke til at similariteten mellem aminosyrerne vises med "|" ved perfect match, med ":" med et mis-match hvor de to aminosyrer deler nogle fysiokemiske egenskaber, og "." hvor aminosyrerne slet ikke minder om hinanden.
• Hvad er alignment score? Svar:  916.0
• Bemærk: Lige netop EMBOSS version af "Needleman-Wunsch" algoritmen ignorer gaps i starten of slutningen når der beregnes alignment score.
  
• Hvad er alignment længden? Svar: 361
  
• Hvad er Identity? (både i % og som fraktion). Svar: 176/361 (48.8%)
  
• Hvad er Similarity? (både i % og som fraktion). Svar: 214/361 (59.3%)
  
  Bemærk at den ene sekvens er længere end den anden (det er derfor, der er 25.5% gaps).
  
  
5. Prøv at aligne sekvenserne igen, men denne gang med "water (local)" algoritmen.
• Hvad er alignment score? Svar: 916.0 
• Hvad er alignment længden nu? Svar: 269
  
• Hvad er Identity? (både i % og som fraktion). Svar: 176/269 (65.4%)
  
• Hvad er Similarity? (både i % og som fraktion). Svar: 214/269 (79.6%)
  
  
• Hvilken af de to metoder giver det bedste alignment? Hvorfor?
  Svar: Da de to sekvenser er af forskellig længde (se også svaret på næste spørgsmål), giver det mest mening at bruge Smith-Waterman algoritmen ("local alignment"), da dette vil give en analyse af forskelle og ligheder for den del af sekvensen der faktisk er sammenlignelig.
  
  Bemærk: Ved local alignment skal man være opmærksom på længden af alignment'et. I dette tilfælde er det vigtigt at bemærke forskellen i starten af sekvensen.
  
  
6. Lad os undersøge hvorfor de to sekvenser er forskellige i starten: Slå begge op i UniProt (http://www.uniprot.org). Klik på extented view for at få alle informationer (alternativt kan man klikke på "flat file" og se det "rå" entry). NB: Er ikke nødvendigt længere - det nye interface virser automatisk denne information.
   
• Hvordan er de sekventeret?
  Svar: P29600 - sekvensen er afledt af 3D struktur. P41363 - oversat fra DNA + information fra protein-sekventering.
  
  
• Hvor i cellen / uden for cellen har enzymerne deres funktion?
  Svar: SUBCELLULAR LOCATION: "Secreted protein" (for dem begge).
  
  
• Feature tabellen fortæller om de forskellige regioner af proteinet - prøv at sammenligne og finde ud af hvad forskellen er (ignorer bare information om sekundær-struktur - TURN, HELIX og STRAND).
  Svar: P29600 starter direkte med sekvensen af det mature protein. P41363 starter med et signal-peptid (pos: 1-24), derefter pro-peptid (25-93), og så først derefter kommer det mature protein. Bemærk at både signal-peptid (funktion: signal til eksport af proteinet) og pro-peptidet (funktion: hjælper protein med at folde korrekt) klippes af inden protein er "modent".
  
  Forskellen er her at P41363 er (primært) oversat fra DNA og derfor indeholder information fra hele den kodende sekvens, mens P29600 er afledt fra 3D struktur, som indeholder den mature sekvens. Savinase indeholder faktisk både signal- og pro-peptid (kan graves frem i databaserne).
  
  
• Ud fra kvaliteten af alignmentet og de informationer du har gravet frem i UniProt, så svar på følgende:
• Er det sandsynligt at man kan bruge P41363 som vaskepulverenzym? Hvorfor, hvorfor ikke?
  Taler for: Samme type protease (serin-protease, S8 familie). Thermostabilt (!). Minder meget som Savinase på sekvens-niveau.
  Mulige problemer: Højt pH optimum - vil evt. kunne optimeres i laboratoriet.
  
  

Trin 2 - om gaps og tvivlsomme alignments

7. Vi skal nu prøve at sammenligne vores Savinase protease (P29600) med en serin protease fra mennesket. Den nedenstående sekvens er fundet gennem GenBank  entry'et "NM_002773" - husk at man for alle GenBank entries med en CDS også kan få fat i den oversatte protein-sekvens.
•  Pedantisk detalje: Teknisk set er det fra det humane genom, og ikke fra GenBank - men det lige meget i denne sammenhæng. Hvis man søger på NM_002773 hos NCBI får man fat på sekvensen med det samme. Link: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide
• Opgave: Tjek sekvensen hos GenBank. Kan vi stole på sekvensen, eller er det bare et tilfældigt DNA fragment?
  Svar: Det vigtige er her, at det er et gen man faktisk ved noget om. Det har et navn (PRSS8), en beskrevet funktion, og der findes en række litteraturhenvisninger om genet. Derudover er den en lang "COMMENT", der fortæller at entry'et er inkluderet i REFSEQ (sættet af høj-kvalitet reference-sekvenser - bemærk linien "This record has been curated by NCBI staff."). Under COMMENT har NCBI også opsummeret genets funktion.
  
  Det er altså ikke bare et tilfældigt DNA fragment.
  

8. Prøv at aligne Savinase med den overstående "Prostasin" sekvens - med globalt alignment algoritmen.
• Hvad er alignment score? Svar: 62.0
  
• Hvad er Identity og Similarity? Svar: Identity:      67/411 (16.3%); Similarity:    97/411 (23.6%)
  
• Hvor stor en del af det samlede alignment udgøres af gaps? Svar: 51.1% - bemærk at det humane protein er den hel del længede end Savinase.
  
  
9. Prøv derefter at aligne sekvenserne med local alignment algoritmen.
• Hvad er alignment score? Hvorfor er den forskellig fra det globale alignment? Svar: 82.5 - Ud over at det lange område med gaps i slutningen er forsvundet, så er områder af mere tvivlsom kvalitet i starten og slutningen af det faktiske alignment også forsvundet.
• Hvad er Identity og Similarity? Svar: Identity:      54/217 (24.9%); Similarity:    79/217 (36.4%).
  
• Hvor stor en del af det samlede alignment udgøres af gaps? Svar: 29.0%
  
  
10. Var der stor forskel mellem de to alignments denne gang?
• Hvilken af de to typer alignment giver mest mening at bruge for meget tæt beslægtede proteiner? Svar: Både global og local alignment. Global er godt til at spotte forskelle som fx. det med signal-peptidet. Hvis sekvenserne er af sammen længde (sådan circa) og er meget ens, vil global og local alignment give samme resultat.
  
• ... for fjernt beslægtede proteiner? Svar: Local alignment
  
  
11. Vi skal nu finde ud af om vi overhovedet tror på alignmentet mellem Savinase og Prostasin. Lad os derfor aligne Savinase med et protein vi ved er noget helt andet - alpha globin. Nedenstående er UniProt entry'et for alpha globin fra Sus scrofa - grisen.
    

12.  Prøv først at aligne Savinase og alpha globin globalt.
• Hvordan ser det ud? (Alignment score, gaps osv.) Svar: Det ser skidt ud - 6.6% identity, 11.1% similarity og 77.2% gaps.
  
• Vil vi ud fra dette alignment tro at de to protein har noget med hinanden at gøre? Svar: Nej.
  
  
13. Prøv derefter at aligne Savinase og alpha globin lokalt.
• Hvordan ser det nu ud? Svar: Hvis man kun kigger på procenterne ser det pludseligt helt godt ud - 28.3% identity, 40.0% similarity og 28.3% gaps. Men dette dækker kun et meget kort alignment (længde: 60).
  
  SUBS_BACLE        39 PDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSA--     86
                       |..|:..|:..|         ..||..||.   ||..::|.|...|.| 
  HBA_PIG           44 PHFNLSHGSDQV---------KAHGQKVAD---ALTKAVGHLDDLPGALS     81
  
  SUBS_BACLE        87 ---ELYAVKV     93
                          :|:|.|:
  HBA_PIG           82 ALSDLHAHKL     91
  
  
• Hvordan ser det ud med længden af alignment i forhold til de to proteiner vi aligner? Svar: Skidt - se ovenstående
  
• Vil vi ud fra dette alignment tro at de to protein har noget med hinanden at gøre? Svar: Nej - alignment'et er simpelthen for kort. Selv hvis man align'er to tilfældige sekvenser, vil der af rent stokastiske årsager være en en smule der kan align'es.
  
  
14. Set i lyset af Savinase+alpha globin alignments'ne, hvordan vil du så vurdere Savinase+Prostasin alignments'ne?
• Er de helt ud i skoven? Svar: Nej, de virker mere plausible - selv ved local alignment kan en stor del af sekvenserne align'es. Det skal dog siges at vi er nede i et gråzone område (identity: ~25%, similarity: ~36%).
  
• Vi er så heldige at vi har ekstra information ang. deres funktion (de er begge serin-proteaser). Hvordan vil der påvirke din bedømmelse af alignments'ne?
  Svar: Som nævnt er vi i et gråzone område, så hvis vi ikke har ekstra information, kan det være svært at afgøre. Ud fra informationen om den fælles funktion og virkemåde, er der muligvis tale om et fjernt slægtskab. Hvis man for alvor skal afgøre det, må man sammenligne protein 3D struktur.
  
• Som tommerfingerregel siger man at grænsen for at kunne afgøre at to proteinsekvenser er beslægtede går ved 25-30%homologi over mindst 100 aminosyrere.
  
  
15. Sæt Gaps'ne fri: Lad os som det sidste inden vi går videre, prøve at gøre det næsten "gratis" for algoritmen at indsætte gaps.
    
• Sæt Gap opening penalty til 1.0 (det mindste man kan).
• Sæt Gap elongation penalty til 0.1 (det mindste man kan).
• Vælg globalt alignment.
  
  
16. Prøv at aligne Savinase + Alpha globin igen.
• Hvordan ser det nu ud med alignmentet (score, gaps, similarity osv). Svar: Ud fra tallene ser det jo ikke så ringe ud mere (Identity: 22.0%; similarity: 29.3% - alignment score: 289.5.
  
• Giver dette alignment overhovedet noget biologisk mening? Svar: Nej (!). Hvis man gør det (næsten) gratis at sætte gaps ind kan man aligne alle sekvenser. Se for eksempel følgende linie fra alignment'et - her er aminosyrerne bare blevet spredt ud med rund hånd:
  
  SUBS_BACLE       134 EQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASF    183
                            ||     |    | :     :     :|:.:          |  
  HBA_PIG           81 -----SA-----L----S-D-----L-----HAHKL----------R---     92
  

NB: Hust at nulstille alignment parameterene inden du går videre (tryk på "Reset" knappen).

Trin 3 - alignment matricer

Ang. alignment matricer:

17.  Lad os gå tilbage til de to prokaryote serin-protease (Savinase + P41363). Vi ved fra første del af øvelsen at de har stor similaritet, så lad os her vælge "PAM100". Generer derefter et lokalt alignment. 2008 - NB: EBI har desværre fjernet mulighed for at vælge andet end BLOSOM62/50/40 - så dette spørgsmål kan ikke besvaret.
    
• Hvad er alignment score? Svar: 942.0
  
• Hvad er alignment længden? Svar: 269
• Hvad er identity score? Svar: 65.4%
  
• Hvad er similarity score? Svar: 81.0%
  
  
• Hvilke scores er forskellige fra dem vi fik før (med BLOSUM62) og hvorfor er de forskellige?
  Svar: Det vigtige er her at de forskellige scores i selve matricen er en anelse anderledes, bla. vil der være en mindre forskel i hvilke aminosyre-par der betragtes som "similar" -> alignment score: lidt højere; similarity: en smule højere. Bemærk at længden samt identity er det samme.
  
  Men der er altså ikke den helt store forskel på de to alignments.
  
  
18. Der var ikke de helt store forskelle at se med de to temmeligt ens proteiner, så lad os istedet kigge på Savinase + Prostasin igen. Vælg "BLOSUM40" som matrice, og generer igen et lokalt alignment.
• Hvad er alignment score? Svar: 236.5
  
• Hvad er alignment længden? Svar: 368
• Hvad er identity score? Svar: 24.5%
  
• Hvad er similarity score? Svar: 42.4%
  
  
• Hvilke scores er forskellige fra dem vi fik før (med BLOSUM62) og hvorfor er de forskellige?
  Svar: Den største forskel er nu at alignment'et er blevet længere samt at "similarity" er gået en del op. Dette skyldes igen ændringer i matricen (henunder hvilke aminosyrer der tæller som "similar").
  
  Bemærk: Forskellen i alignments'ne er meget større end det vi så når man ændrer matricen for allerede "godt" alignment.